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生理生化实验
微生物对生物大分子的分解利用
淀粉水解实验
原理:某些细菌可以产生淀粉酶,可将培养基中的淀粉水解为糖类,在培养基上滴加碘试剂后可与培养基中未转化的淀粉作用呈深蓝色反应,而菌落周围的淀粉由于被淀粉酶水解与碘不发生反应而呈现透明圈。
实验方法:1.接种。2.观察记录。
结果判定:试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间、培养基含有淀粉量和PH值等均有一定的关系,培养基必须为中性或微酸性,以PH值为7.2最适。
应用:重型白喉棒状杆菌产生淀粉酶,能分解淀粉,可用于鉴定。
明胶水解试验
原理:明胶是由胶原蛋白水解产生的蛋白质,在25摄氏度以下以固体形式存在,25摄氏度以上会液化。但有些微生物可产生一种为明胶酶的胞外酶,水解明胶使其液化,甚至在4摄氏度仍能保持液化状态。
试验方法:1.接种。2.观察记录。
试验结果:明胶被液化,即为试验阳性。
应用:普通变形杆菌、奇异变形杆菌、沙雷氏菌、阴沟肠杆菌等能液化明胶。
油脂水解试验
原理:某些细菌能够分泌脂肪酶,能将培养基中的脂肪水解为甘油和脂肪酸,所产生的脂肪酸可通过预先加入油脂培养基中的中性红指示剂(指示范围为PH6.8红-PH8.0黄)。当细菌分解脂肪产生脂肪酸时,培养基中出现红色斑点。。
试验方法:1.接种。2.观察记录。
试验结果:如出现红色斑点,说明脂肪水解为阳性反应。
微生物对含碳化合物的分解利用
糖(醇、苷)类发酵实验
原理:根据不同细菌分解糖、醇、苷的能力不同,有的产酸产气,有的产酸不产气,有的根本不利用某些糖、醇、苷。酸的产生可以利用指示剂来证明,在培养基中加入溴甲酚紫(变色范围PH5-7,PH值为5时呈黄色,PH为7时为紫色),当发酵产酸时,可使培养基由紫色变为黄色。有无气体的产生,可从培养基中倒置的杜汉氏管的上端有无气泡判断。
试验方法:1.接种。2.观察记录。
试验结果:与对照管比较,若接种培养液保持原有颜色,其反应结果为阴性,表明该菌不能利用该糖,用“-”表示;若呈黄色,则为阳性,表明该菌能分解该种糖产酸。若有气泡产生,表明该菌分解糖能产酸并产气,记录用“+”表示
应用:肠杆菌科的细菌鉴定;
葡萄糖代谢类型鉴别实验
原理:某些细菌在分解葡萄糖的过程中,必须有分子氧参加的为氧化型,氧化型的细菌在无氧环境中不能分解葡萄糖;细菌在分解葡萄糖的过程中,可以进行无氧降解的,称为发酵型,不分解葡萄糖的细菌,称为产碱型。
试验方法:挑取待试菌纯种培养物分别穿刺接种到两支HL培养基中,其中一支接种后滴加融化的1%琼脂液于培养基表面,也可加灭菌液体是啦或凡士林,高度约1cm,于35~37摄氏度,一般培养48h以上,观察
培养基;Hugh-Leifson培养基
应用:鉴别葡萄球菌和微球菌;鉴别革兰氏阴性菌。
甲基红试验
原理:某些细菌在糖代谢过程中,分解培养基中的糖产生丙酮酸,丙酮酸再被分解为甲酸、乙酸、乳酸等,使培养基中的PH值降到4.5以下,酸的产生可由在培养基中加入甲基红指示剂的变色来指示。
培养基:葡萄糖缓冲蛋白胨水
试验方法:1.接种。2,观察记录。沿管壁加入2~3滴甲基红指示剂
试验结果:若培养液上层变为鲜红色,记录为MR试验阳性反应(“+”);若仍呈黄色,记录为阴性(“-”);橘红色为弱阳性。
应用:鉴别大肠埃希氏菌和产气肠杆菌;
乙酰甲基甲醇(V-P)试验
原理:某些细菌可分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸通过缩合和脱羧反应产生乙酰甲基甲醇,此物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰可以与培养基中蛋白胨的精氨酸的胍基作用,生成红色化合物。
培养基:葡萄糖缓冲蛋白胨水
试验方法:1.接种:将分离得到的待试菌纯种培养物接种到葡萄糖缓冲蛋白胨水中。2.观察记录
试验结果:阳性反应立刻或于数分钟内出现红色,如为阴性,应放在35~37摄氏度下培养4h再进行观察。
应用:本实验常与MR试验一起使用,一般情况下,前者为阳性的细菌,后者为阴性,反之亦然。
β-半乳糖苷酶试验
原理:两种不同系统的酶作用分别为半乳糖渗透酶和β-半乳糖苷酶,具有上述两种酶的细菌,能迅速分解乳糖。当细菌只有β-半乳糖苷酶,而缺乏半乳糖苷渗透酶,或是其活性较弱,不能很快将乳糖运送到细菌细胞内,所以需要几天时间的培养才能延缓分解乳糖。
培养基:ONPG培养基
试验方法:1.接种。2.观察记录。
试验结果:培养基呈黄色为阳性结果,24h不呈现黄色为阴性结果。
应用:可用于迟缓发酵乳糖细菌的快速鉴定
微生物对含氮化合物的分解利用
靛基质(吲哚)试验
原理:分解色氨酸产生的吲哚可对二甲基氨基苯甲醛结合,形成红色的玫瑰吲哚。
试验方法:1.接种。接种到蛋白胨水中。2.观察记录
试验结果:阳性结果者加入柯凡克试剂后,试剂层为红色,不变色的为阴性结果。
应用:用于肠杆菌科细菌的鉴定
硫化氢产生实验
原理:有些细菌能分解蛋白质中含硫的氨基酸产生硫化氢。硫化氢遇到培养基中的铅盐或铁盐,可产生黑色硫化铅或硫化铁沉淀,从而可以确定硫化氢的产生。
试验方法:1.接种。挑取待试菌纯种固体琼脂培养物,沿硫酸亚铁琼脂管壁穿刺,然后悬挂醋酸铅纸条。于35~37摄氏度培养1-2d。2.观察结果
试验结果:试纸或培养基变成黑色为阳性结果,阴性则培养基和试纸均不变色。
应用:肠杆菌科中的沙门氏菌属、柠檬酸杆菌属、爱德华氏菌属和变形杆菌属多为阳性,其他菌属为阴性。
尿素酶实验
原理:尿素琼脂含有尿素、葡萄糖和酚红,酚红在PH6.8时为黄色,而在培养过程中,产生尿素酶的细菌将尿素分解产生氨,使培养基的PH升高,在PH升至8.4时,指示剂就会转变为深粉红色。
试验方法;1.接种。在尿素琼脂斜面划线接种。2.观察记录。
试验结果:阳性者由于产生碱性物质使培养基变成红色,不变色的为阴性结果。
应用;主要用于肠杆菌科中变形杆菌族的鉴定。
氨基酸脱羧酶实验
原理:某些细菌能产生氨基酸脱羧酶,可使赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸等生产脱羧作用,生成胺类物质和二氧化碳,胺类物质使培养基呈碱性,使酸碱指示剂溴甲酚紫变色呈现深紫色。
试验方法:1.接种。接种氨基酸脱羧酶试验培养基和对照培养基。2.观察记录。
试验结果:氨基酸脱羧酶阳性者由于产生碱性物质,培养基应呈紫色;阴性者无碱性产物,但因葡萄糖产酸而使培养基变成黄色,对照管应为黄色。
应用:赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶实验对沙门氏菌均为阳性,但伤寒沙门氏菌和鸡沙门氏菌鸟氨酸为阴性。
苯丙氨酸脱酸试验
原理:某些细菌具有氨基酸脱氨酶,可使多种氨基酸发生氧化脱氨基作用,生成α-酮酸,进而与加入的三氯化铁试剂发生反应,呈现不同的颜色变化。
试验方法:1.接种。划线接种于苯丙氨酸琼脂。2.观察记录。
试验结果:斜面呈现绿色为阳性结果;斜面不变色为阴性结果。
应用:主要用于肠杆菌科中细菌的鉴定。
产氨试验
原理:某些细菌能使蛋白质中氨基酸在各种条件下脱去氨基,生成各种有机酸和氨,氨的产生可通过与氨试剂(如奈氏试剂)超反应而加以鉴定。
试验方法:以无菌操作分别接种供试菌至牛肉膏蛋胨培养液试管中,空白对照管不接菌,做好标记,置37°C 恒温箱中,培养24h°取出以上试管,向培养液内各加入3-5滴氨试剂°若培养液中出现黄色(或棕红色)沉淀者为阳性反应(用“+”表示):不出现上述沉淀的为阴性反应(用"-″表示)。
酶类试验
呼吸酶类试验
氧化酶试验
原理:氧化酶即细胞色素氧化酶,是细胞色素呼吸酶系统的终端呼吸酶。
试验方法:1.滤纸法2.菌落法3.试剂纸片法
应用:可用于区别假单胞菌可与氧化酶阴性肠杆菌科的细菌。
细胞色素氧化酶试验
原理:待检菌如果有细胞色素氧化酶,在分子氧存在的情况下首先使细胞色素C 氧化,然后氧化型的细胞色素C 再使对笨二胺氧化,并和a-萘酚结合,生成吲垛酚蓝(靛酚蓝),呈蓝色仅应。
试验方法:1.接种。取37摄氏度培养20h的待试菌纯种斜面培养物一支,将两种试剂各2-3滴,从斜面上端滴下,并将斜面略加倾斜,使试剂混合液流经斜面上的培养物。2.观察记录
试验结果:阳性者30s内产生蓝色反应,阴性反应观察至2min,要注意超过2min,由于试剂在空气中会被氧化而出现假阴性反应。
过氧化氢酶实验(触媒实验)
原理: 大多数好氧或兼性厌氧微生物能产生过氧化氢酶。 具有过氧化氢酶的细菌。
试验方法:1.接种。 条取代氏菌纯种培养物接种环,置于洁净试管内或 玻片上,滴加3%过氧化氢溶液2ml,或直接滴加3%过氧化氢于不含血液的细菌培养物中,立即观察结果。2.观察记录。
试验结果:阳性者半分钟内产生大量气泡,阴性者不产生气泡。
应用:常用于革兰氏阳性球菌的初步分析。
硝酸盐还原试验
原理;
硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨,再有氨转化为氨基酸和细胞内其他含氮化合物;二是在分解代谢过程中,硝酸盐或亚硝酸盐代替氧化为呼吸酶系统中的终末受氢体。硝酸盐还原试验系测定还原过程中所产生的亚硝酸,在酸性环境下,亚硝酸盐能与对氨基苯磺酸作用,生成对重氮苯磺酸,当对重氮苯磺酸与N -萘胺相遇时,结合成为紫红色的偶氮化合物N-萘胺偶氮磺酸。
试验方法:1.接种。调取分离得到的待试菌纯种培养物接种到硝酸盐培养基。2.观察记录。
试验结果:立刻或10min内出现红色为阳性。
应用:在细胞鉴定中广泛应用。
毒性酶类试验
卵磷脂酶试验
原理:有些细菌能产生卵磷脂酶,即α-毒素,在有钙离子存在时能迅速分解卵磷脂生成甘油酯和水溶性磷酸胆碱,当这些微生物在卵黄琼脂培养基上生长时,菌落周围会形成浑浊带,在卵黄胰胨培养液中生长时,可出现白色沉淀。
试验方法:1.接种。接种或点种于卵黄琼脂平板上。2.观察记录。
试验结果:卵磷脂阳性的菌株,在35到37℃培养三小时,就会在菌落周围形成乳白色浑浊环,即为阳性,六小时后可扩展至五到6mm。
应用:厌氧菌的鉴定。
其他酶类试验
DNA酶试验
原理:某些细菌产生DNA酶,可使长链DNA水解成寡核苷酸链。因为长链DNA可被酸沉淀,寡核苷酸链则溶于酸,所以当在菌落平板上加入酸后,会在菌落周围出现透明环。
试验方法:将被检菌点种于上述平板上,于35℃培养18到24小时,然后1mol/L盐酸覆盖平板,观察结果。
试验结果:在菌落周围出现透明环为阳性,无透明环为阴性。
应用:细菌的鉴别。
酯酶试验
CAMP试验
原理:B群链球菌能产生CAMP因子,可促进葡萄球菌的B-溶血素溶解红细胞的活性。
试验方法:先以β-溶血素的金黄色葡萄球菌划一横线接种于血琼脂平板上,再将被检菌与前一划线作垂直接种,两线不能相交,相距0.5~1cm,于
37℃培养18到24小时。
结果:交界处出现箭头样的溶血区为阳性
应用:特异性鉴定。
有机酸及铵盐利用试验
柠檬酸盐利用实验
原理:不同细菌利用柠檬酸盐的能力不同,有的细菌能利用柠檬酸盐作为碳源,有的不能。某些细菌能利用铵盐作为唯一的氮源,同时利用柠檬酸盐作为唯一的碳源,他们可在柠檬酸盐培养基上生长,将柠檬酸盐分解为二氧化碳,随后形成碳酸盐,使培养基碱性增加,可根据培养基中添加的指示剂的变色来判断结果。
试验方法:1.接种。将分离得到的待试菌纯种培养物挑取少量划线接种到西蒙氏柠檬酸盐培养基中,也可将待试菌纯种培养物做成生理盐水菌悬液后, 挑取一环划线接种于西蒙氏柠檬酸盐培养基中,35~37摄氏度培养1~4天。2.观察记录。
试验结果:阳性者鞋面上有菌落生长,同时培养基变成蓝色;阴性者斜面上无细菌生长,培养基仍然保持原色(绿色)。
应用:作为肠杆菌科中各菌属间的鉴别实验。
葡萄糖铵试验
原理:有些细菌可利用安阳作为唯一氮源,且不需要尼克酸和某些氨基酸作为生长因子时,可以在葡萄糖安培养基上生长并分解葡萄糖产酸,酸碱指示剂澳麝香草酚蓝变色,培养基变成黄色。
试验方法:1.接种。2.观察记录。
试验结果:阳性者在对照培养基上生长良好,同时在葡萄糖胺培养基上变为黄色。
应用:埃希氏菌属葡萄糖胺实验为阳性,志贺氏菌属为阴性。
抑菌试验
氰化钾实验
原理:氰化钾可以抑制某些细菌的呼吸酶系统。
试验方法:1.接种。将分离得到的待试菌纯种培养物接种于蛋白胨水中成为稀释菌液,挑一环接种于氰化钾培养基,并另挑取一环接种于对照培养基。2.观察记录。
试验结果:若培养基对照管均生长,表示不受氰化钾抑制。若实验管无细菌生长为阴性,表示该菌受氰化钾抑制。
应用:常用于肠杆菌科各属的鉴别
杆菌肽敏感实验
原理:A群链球菌对杆菌肽几乎是100%敏感,而其他群链球菌对杆菌肽通常耐药。
试验方法:用灭菌的棉拭子或涂布器取待检菌的肉汤培养物,均匀涂布于血平板上,用灭菌镊子夹取每片含有0.04的单位的杆菌肽纸片置于上述平板上,35到37℃培养18到24小时,观察结果。
试验结果:有抑菌圈出现即为阳性。
应用:主要用于A群与非A群链球菌的鉴别。