酶工程第五章酶分子修饰

• ​通过各种方法使酶分子结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程，称为酶分子修饰。

  基因定位突变技术，可把酶分子修饰后的信息贮存在DNA之中，经过基因克隆和表达，就可通过生物合成方法不断获得具有新的特性和功能的酶，使酶分子修饰展现出更广阔的前景。

• ​第一节 金属离子置换修饰

  • ​定义：通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法称为金属离子置换修饰，简称为离子置换法 eg a-淀粉酶的Ca2+

  • 酶分子结构中除去其所含的金属离子，酶往往会失活 重新加入原有的金属离子，酶可以恢复原有活性 加进不同的金属离子，则可使酶呈现不同的特性 有的降低酶活 有的提升酶活 往往是二价金属离子​

  • ​EDTA结合金属离子，形成螯合物，然后利用透析，超滤，分子筛等出去螯合物。再加入别的金属离子

• ​第二节 大分子结合修饰

  • ​利用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合修饰法，简称为大分子结合法PS: 必须通过试验确定最佳的修饰剂的种类和浓度 控制好温度、pH值和反应时间

  • ​常用修饰剂：右旋糖酐、聚乙二醇、肝素、蔗糖聚合物、聚氨基酸

  • ​优点：提高酶活 增加稳定性 降低或消除抗原性

• ​第三节 肽链有限水解修饰

  • ​酶蛋白的肽链被水解以后，将可能出现以下3种情况                                在后两种情况下，肽链的水解在限定的肽键上进行，称为肽链有限水解。

    • ​若肽链水解后引起酶活性中心的破坏，则酶将失去其催化功能；

    • 若将肽链的一部分水解后，仍可维持其活性中心的完整构象，则酶的活力仍可保持或损失不多；​

    • ​若肽链的一部分水解除去以后，有利于活性中心与底物的结合并且形成准确的催化部位的话，则酶可显示出其催化功能或使酶活力提高

  • ​一、肽链有限水解修饰 利用肽链的有限水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性和功能的方法，称为肽链有限水解修饰。

• ​第四节 酶蛋白侧链基团修饰

  • ​酶蛋白侧链基团：就是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。形成副键，影响空间结构

    • ​氨基、羧基、巯基、咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、甲硫基

  • 氨基修饰剂​

    • 凡能使酶蛋白侧链上的氨基发生改变的化合物，称为氨基修饰剂。​

    • ​主要有：

      亚硝酸、2，4-二硝基氟苯、丹磺酰氯、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、乙亚胺甲酯、O-甲基异脲、顺丁烯二酸酐等

  • ​羧基修饰剂

    • ​可与酶蛋白侧链上的羧基反应的小分子化合物称为羧基修饰剂。

  • ​胍基修饰剂

    • ​ 精氨酸含有胍基。胍基可与二羰基化合物缩合生成稳定的杂环。所以二羰基化合物，如环己二酮、乙二醛、苯乙二醛等，都可以用作胍基修饰剂。经过胍基修饰后的酶蛋白，其空间构象将有所改变。

  • ​巯基修饰剂

    • ​蛋白质的半胱氨酸残基侧链含有巯基。巯基在许多酶中充当活性中心的催化基团，巯基可与另一巯基形成二硫键，对维持酶的结构稳定性起重要作用。若经修饰，使酶蛋白侧链的巯基发生改变，将对酶的特性或功能起显著影响。

  • ​酚基修饰剂

    • ​蛋白质的酪氨酸残基上含有酚基。修饰酚基的主要方法有碘化法、硝化法和琥珀酰化法等。

  • ​分子内交联剂

    • ​用含有双功能团的化合物，如二氨基丁烷、戊二醛、己二胺等，与酶分子内两个侧链基团反应，在分子内共价交联，可使酶分子空间构象更加稳定，从而也使酶的催化稳定性增加。

• ​第五节 氨基酸置换修饰

  • ​若将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，则会引起酶蛋白空间构象的某些改变，从而改变酶的某些特性和功能，这种修饰方法，称为氨基酸置换修饰

  • ​蛋白质工程又被称为第二代遗传工程。是指通过改造与蛋白质相对应的基因中的碱基排列次序，或设计合成新的基因，将它克隆到寄主细胞中，通过基因表达而获得具有新的特性的蛋白质的技术过程。

  • ​蛋白质工程主要步骤

    • ​新蛋白质结构的设计

      • ​根据已知的蛋白质或酶的化学结构、中间结构及其特性，确定欲得到的新蛋白质或酶的氨基酸排列次序。确定欲置换的氨基酸及位置

    • ​突变基因的核苷酸序列的确定

      • ​根据欲得到的蛋白质的氨基酸序列，确定其对应的mRNA上的核苷酸序列，再根据互补原则，从mRNA核苷酸序列确定其所对应的突变基因上的核苷酸序列。依据欲置换的氨基酸确定需要置换的核苷酸及其位置。

    • ​突变基因的获得

      • ​利用定位突变技术，突变基因中所需置换的核苷酸数目往往很少。若需在肽链中置换一个氨基酸，其所对应的基因上只需置换1—3个核苷酸。

        • ​β—干扰素的修饰是将其第17位的半胱氨酸换成丝氨酸，故此只须在其对应基因的相应位点上将ACA或ACG(转录到mRNA上遗传密码为UGU或UGC)换成TCA或TCG(转录后为AGU或AGC)，实际上突变基因是在某特定位点上将A换成T即可；

      • ​根据欲得到的突变基因的核苷酸序列以及需要置换的核苷酸位置，首先用DNA合成仪合成有一个或几个核苷酸被置换了的寡核苷酸，再用此寡核苷酸为引物，通过定点突变技术，而获得所需的突变基因。这称之为寡核苷酸诱导的定位突变，是蛋白质工程中最常用的技术

    • ​新蛋白质的产生

      • ​将上述获得的突变基因插入到合适的基因载体中，转化或转导到宿主细胞之中，在适宜的条件下进行表达，就可产生出经过氨基酸置换的新的蛋白质或酶。

• ​第六节 物理修饰

  • ​通过各种物理方法，使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法称为物理修饰

  • ​在于不改变酶的组分和基因，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理方法的作用下，副键发生某些变化和重排。

  • ​eg 用高压方法处理纤维素酶以后，该酶的最适温度有所降低，在30、40°C的条件下，高压修饰酶比天然酶的活力提高l0%。