蛋白质化学

• 蛋白质结构与功能的关系

  • ​蛋白质一级结构与功能的关系

    • ​一级结构的变异与分子病

      • ​镰刀型贫血病

        • ​症状

          • ​缺氧时红细胞形状易变

          • ​溶血，形成血栓

        • ​一级结构决定空间结构，空间结构的变化影响蛋白质的功能

          • ​HbS（镰刀状细胞的血红蛋白）和HbA(正常细胞的血红蛋白)氨基酸序列的细微变化

            • ​ $$ β6位从正常的谷氨酸变为缬氨酸，从而使得一个极性氨基酸变为疏水氨基酸，从而易聚合

            • ​脱氧时，分子间聚合成纤维丝，再聚合成刚性纤维束，从而使细胞变性、破裂、堵塞毛细血管

    • ​一级结构的序列比较

      • 概念

        • ​蛋白质家族

          • ​不同生物中的一些蛋白具有共同的祖先，有相似的氨基酸序列，执行相似的功能，这些蛋白组成了蛋白质家族

        • ​同源蛋白质

          • ​家族中的各个成员是同源蛋白质

        • ​序列的同源性

          • ​同源蛋白一级结构的相似性

      • ​蛋白质序列可以阐明地球上生命的进化

        • ​说明蛋白质的进化可以反应生物物种的进化

  • ​蛋白质空间结构与功能的关系

    • ​牛胰核糖核苷酸酶A的折叠与去折叠

      • 牛胰核糖核苷酸酶（RNase A）

        • ​RNA水解酶

        • ​单肽链

        • ​124个氨基酸残基

        • ​4个链内二硫键

        • ​球形

      • ​RNase A的去折叠和重新折叠实验

        • ​证明了蛋白质的空间结构决定其功能

        • ​蛋白质的一级结构决定其空间结构

    • ​肌红蛋白、血红蛋白与氧的结合

      • ​结构和功能上的相似之处

        • ​肌红蛋白为单亚基蛋白

        • ​血红蛋白为四聚体蛋白，各亚基三位结构与肌红蛋白相似，都含有血红素辅基

        • ​与氧结合的机制相同

      • ​两者在结构和功能上存在差异

        • ​血红蛋白是四聚体蛋白，肌红蛋白是单亚基蛋白

        • ​血红蛋白在血液中运输氧

        • ​肌红蛋白在肌肉组织中贮存和供应氧

      • ​两者与养的结合具有不同的特点

        • ​氧结合曲线不同，P50越小，蛋白质与氧的亲和性越高

          • ​

        • ​肌红蛋白氧结合曲线是双曲线

        • ​血红蛋白的氧结合曲线是S型曲线

          • ​对氧浓度的变化更为敏感

      • ​氧结合显著改变血红蛋白四级结构

        • ​血红素Fe 2+ 与氧结合后， 由高自旋→ 低自旋，半径缩小，进入卟啉环的空穴。

      • ​别构效应

        • ​寡聚蛋白质中，由于一个亚基构象的改变而引起其余亚基以至整个分子的构象、性质和功能的变化

        • ​别构效应使得血红蛋白对氧的敏感度提高

        • ​单亚基的肌红蛋白没有别构效应

    • ​朊病毒与构象病

  • ​蛋白质三级结构的预测简介

  • ​蛋白质组与蛋白质组学简介

• 蛋白质的重要性质

  • ​蛋白质的胶体性质

    • ​蛋白质溶液时稳定的亲水胶体

      • ​直径：2-20nm

      • ​带同种电荷

      • ​水化层

  • ​蛋白质的两性解离和等电点

    • ​蛋白质的解离基团： 氨基酸残基的

      R 基团 、末端α- 氨基和α-羧基

    • ​等电点沉淀：处于等电点的蛋白质

      在溶液中的溶解度最小。

    • ​蛋白质的等电点是由其所含氨基酸的种类和数量决定

  • ​蛋白质的沉淀

    • ​高浓度中性盐沉淀蛋白质

      • 盐析：高浓度的中性盐离子破坏水化层，使蛋白质沉淀，但是不引起变性

      • ​盐溶

        • ​蛋白质吸附少量盐离子后，带同种电荷而互相排斥，并增加了与水的作用，导致蛋白质溶解性提高

    • ​有机溶剂沉淀蛋白质

      • ​破坏水化层，脱水而沉淀。易引起变性

    • ​重金属离子沉淀蛋白质

      • ​带负电荷的蛋白质分子与重金属形成不溶性的重金属盐沉淀，但是会引起变性

    • ​生物碱试剂沉淀蛋白质

      • ​带负电荷的酸性物质

      • ​与带正电荷的蛋白质形成不溶性的盐而沉淀

    • ​加热变性沉淀蛋白质

      • ​加热使蛋白质变性而凝固

      • ​加热破坏了蛋白质的天然结构，疏水基团外露，破坏了水化层

  • ​蛋白质的变性与复性

    • ​蛋白质的变性

      • ​次级键断裂

      • ​天然构象改变

      • ​生物学活性丧失

      • ​理化性质改变

    • ​蛋白质的复性

      • ​恢复天然构象

      • ​恢复生物学活性，理化性质

    • ​引起蛋白质变性的物理和化学因素

      • ​物理因素

        • ​加热、紫外线、X-射线、高压、表面张力的拉伸

      • ​化学因素

        • ​有机溶剂、脲、胍、酸、碱

  • ​蛋白质的颜色反应

    • ​双缩脲反应

      • ​NaOH、CuSO4

      • ​紫红色

    • ​酚试剂反应

    • ​茚三酮反应

      • ​茚三酮

      • ​蓝紫色

  • ​蛋白质的紫外吸收光谱

    • ​色氨酸最强，苯丙氨酸最弱，酪氨酸居中

    • ​最大紫外吸收波长为280nm

• 蛋白质的元素组成

  • ​组成蛋白质的主要元素有碳、氢、氧、氮、硫

  • ​蛋白质含量=含氮量*100/16=含氮量*6.25

• ​蛋白质的分离纯化

  • 蛋白质的分离纯化技术

    • ​透析与超过滤

      • ​透析

      • ​超过滤

    • ​电泳技术

      • ​聚丙烯酰胺凝胶电泳

      • ​SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

      • ​等电聚焦电泳

      • ​蛋白质双向电泳

    • ​层析技术

      • ​凝胶过滤层析

      • ​离子交换层析

      • ​亲和层析

    • ​超速离心

      • ​离心分离蛋白质，基于蛋白质密度差异，重的在下面

      • ​沉降速度 $S= \frac{V}{ ω ^{2}r }$ 

      • ​蛋白质、核酸、病毒、核糖体的沉降系数： $1 × 10 ^{-13}$ 秒—— $200× 10 ^{-13}$ ，可直接描述生物大分子或细胞器的大小

      • ​把 $10 ^{-13}$ 秒称为斯维得贝格单位，用S表示

    • ​生物质谱技术简介

  • ​分离纯化的一般原则

    • ​前处理

    • ​粗分级

    • ​细分级

      • ​鉴定

    • ​蛋白质的储存

  • ​分离纯化的基本原理

    • ​根据分子大小不同

    • ​根据溶解度差异

    • 根据电荷不同

    • ​根据对配基的特异亲和性

  • ​蛋白质的纯度鉴定

    • ​SDS-PAGE

    • ​酶活力测定

• ​蛋白质的分类

  • 按化学组成分类

    • ​简单蛋白质

    • ​结合蛋白质

      • ​分子中除氨基酸之外，还有非氨基酸组分，后者称为辅因子

  • ​按分子形状分类

    • ​球状蛋白质

      • ​紧凑、多样化

    • ​纤维蛋白质

      • ​不溶于水

    • ​膜蛋白

• ​蛋白质的基本组成单位——氨基酸

  • ​蛋白质的常见氨基酸

    • ​定义：含有氨基和羧基的有机化合物叫氨基酸

    • ​氨基酸中c编号方式——以羧基中的C原子为C-1，侧链依次往下排，而用希腊字母表示是，将与所及相连的C原子记作α-C，即α-C是C-2

    • ​氨基酸结构通式：一般以L-α氨基酸的结构通式为准

  • 氨基酸的分类

    • ​​R基团为非极性或疏水性的氨基酸

      • ​

        • ​丙氨酸（Ala,A）

        • ​缬氨酸（Val，V）

        • ​亮氨酸（Leu，L）

        • ​异亮氨酸（Ile，I）

        • ​甲硫氨酸（Met，M）

        • ​脯氨酸（Pro，P）

        • ​苯丙氨酸（Phe，F）

        • ​色氨酸（Trp，W）

    • ​R基团为极性不带电荷的氨基酸

      • ​

        • ​丝氨酸（Ser，S）

        • ​苏氨酸（Thr，T）

        • ​酪氨酸（Tyr，Y）

        • ​半胱氨酸（Cys，C）

        • ​天冬酰胺（Asn，N）

        • ​谷氨酰胺（Gln，Q）

        • ​甘氨酸（Gly，G），唯一不含手性碳原子的常见氨基酸

    • ​R基团带电荷的氨基酸

      • ​带正电荷

        • ​

          • ​天冬氨酸（Asp，D）

          • ​谷氨酸（Glu，E）

      • ​带负电荷

        • ​

          • ​赖氨酸（Lys，K）

          • ​组氨酸（His，H）

          • ​精氨酸（Arg，R）

  • ​蛋白质中的稀有氨基酸

    • ​遗传密码只对应20种常见氨基酸，除此以外，有些氨基酸没有对应的遗传密码子，是经过翻译后加工修饰而来，称为稀有氨基酸

      • ​蛋白质合成后加工修饰的

      • ​蛋白质合成时掺入

        • ​第21种氨基酸——硒代半胱氨酸

        • ​第22种——吡咯赖氨酸

  • ​非蛋白质氨基酸

    • ​大多是蛋白质中常见的氨基酸衍生物，大多数是L-α-氨基酸，有些是D型氨基酸，还有些是β-，γ-，或δ-氨基酸

    • ​具有广泛的生理功能：细菌细胞壁、维生素泛酸的组成部分

    • ​不存在于蛋白质中，而是以游离或结合的形式存在于生物体内

  • ​氨基酸的酸碱性质

    • ​氨基酸的氨基和羧基都可以解离，使氨基酸表现出酸碱性，作为分离鉴定氨基酸的一种依据

      • ​氨基酸的偶极离子形式

        • ​氨基酸在晶体和水溶液中主要以偶极离子或称为兼性离子的形式存在，羧基解离带上一个负电荷，氨基质子化带上一个正电荷，因此氨基酸分子中既带有正电荷又带有负电荷。电中性状称为偶极离子形式。

          • ​

      • ​氨基酸的两性解离

        • ​酸是质子的供体，碱是质子的受体。氨基酸既是酸也是碱

          • ​只含有一个氨基和一个羧基的氨基酸，完全质子化时可以看作二元酸，只有当侧链基团也能解离的氨基酸完全质子化时可看作三元酸

            • ​二元酸

              • ​以K1表示α-羧基的解离常数，K2表示α-氨基的解离常数

                • ​阶段一：α-羧基解离，中点时pK1=pH

                • ​阶段二：α-氨基解离，中点时pK2=pH

            • ​三元酸

              • ​除了pK1、pK2，还有pKR（侧链基团的解离常数）

      • ​氨基酸的等电点

        • ​等电点的概念

          • ​当氨基酸主要以偶极离子形式存在，所带净电荷为零时，溶液的pH值为该氨基酸的等电点，用pI表示

        • ​氨基酸的溶解度、所带电荷及在电场中的运动随溶液的pH值变化

          • ​pH>pI，氨基酸带负电荷，在电场中向正极移动

          • ​pH<pI，氨基酸带正电荷，在电场中向负极移动

          • ​pH=pI，氨基酸净电荷为零，在电场中不移动，此时氨基酸处于等电点，所以其溶解度最小

        • ​等电点的计算

          • ​中性氨基酸

            • ​

          • ​酸性氨基酸

            • ​pI = 1/2(pK 1 +pK R )

          • ​碱性氨基酸

            • ​ pI = 1/2(pK R +pK 2 )

  • 氨基酸的立体化学

    • ​连接四个不同原子或基团的碳原子称为不对称碳原子，具有旋光性，也称为手性，氨基酸立体构型以甘油醛为参照物，一般为L型，即α-氨基处于α-C的左侧，但是构型只指相对构型，与旋光性无关

    • ​互为实物和镜像，又不能重合的分子互称为对映异构体

      • ​旋光能力相同，旋光性方向相反

      • ​生理活性不同

      • ​其他物理、化学性质完全相同

  • 氨基酸的吸收光谱

    • ​20种氨基酸在可见光区没有吸收，在红外区和远紫外区都有光吸收，主要有三个芳香族氨基酸

      • ​色氨酸紫外线吸收最强

      • ​酪氨酸

      • ​苯丙氨酸紫外线吸收最弱

      • ​蛋白质的最大紫外吸收波长在280nm

  • ​氨基酸的化学反应

    • ​茚三酮反应

      • ​α- 氨基和α- 羧基共

        同参加的反应，产物为蓝紫色复合物，最大吸收峰在570nm吗，一分子氨基酸与两分子茚三酮反应

      • ​脯氨酸与茚三酮反应产物为黄色，最大吸收在440nm

    • ​Sanger反应

      • ​反应试剂：2,4- 二硝基氟苯，简称FDNB

      • ​反应产物为黄色物质，2,4-二硝基苯基氨基酸，简称DNP-氨基酸（

      • ​会使肽链完全水解，可以用于多肽N-端测定

    • ​Edman反应

      • ​反应试剂：苯异硫氰酸酯（PITC）

      • 反应原理：在弱碱性条件下，PITC与α-氨基反应，生成PTC-氨基酸，在硝基甲烷种与酸作用名称成PTH-氨基酸，无色，最大吸收峰在268nm，经过层析法分离后显色加以鉴定。

      • ​只会使N-末端的肽链断裂后，暴露一个新的N-末端氨基酸，从而可以测定整条氨基酸的顺序

• 蛋白质的分子结构

  • ​蛋白质的结构层次

  • ​蛋白质的一级结构

    • ​蛋白质一级结构的概念

      • ​多肽链中氨基酸残基的排列顺序

    • 举例

      • ​胰岛素

      • ​核糖核苷酸

        • ​第一个测出一级结构的酶分子

        • ​具有高度专一性的RNA内切酶

    • ​蛋白质一级结构的测定

      • 蛋白质序列测定的一般步骤

        • ​测序前的准备工作：测定蛋白质的分子量，多肽链的数目和氨基酸组成

        • ​末端分析（N段分析和C端分析）

        • ​肽链的拆开和分离

        • ​用至少两种方法对每条肽链部分水解，分离纯化水解的肽段

        • ​肽段的氨基酸序列测定

        • ​找重叠肽段，推断出整个肽链的氨基酸序列

        • ​二硫键位置的确定

      • ​蛋白质序列测定中的一些具体方法

        • ​N-末端氨基酸残基的测定方法

          • Sanger法

          • ​Edman降解法

          • ​丹黄酰氯法

            • 原理与Sanger的FDNB法相同，只是用DNS代替了FDNB

            • 丹黄酰基灵敏度比FDNB高100倍

          • ​氨肽酶法

            • ​肽链外切酶：从肽链的N-端逐个水解氨基酸残基

        • ​C-末端氨基酸残基的测定方法

          • ​肼解法：将多肽同肼在无水条件下加热，层析测定

          • ​还原法：用硼氢化锂将C-末端氨基酸还原成α-氨基醇

          • ​羧肽酶法：肽链外切酶，从C-末端开始出个断裂肽键

        • ​断裂二硫键的方法

          • ​过甲酸氧化

            • ​不能再重新形成二硫键，有利于肽链的分离

          • ​巯基试剂还原法

        • ​二硫键位置的确定

          • 胃蛋白酶水解结合对角线电泳

        • ​多肽链的断裂方法

          • ​蛋白酶断裂法：用肽链内切酶

          • ​化学断裂法：溴化氰，专一断裂Met羧基参与形成的肽键

        • ​氨基酸组成的测定

          • ​用氨基酸残基摩尔数

          • ​酸/碱水解

          • ​完全水解后，用氨基酸分析仪测定

  • ​蛋白质的二级结构

    • ​二级结构的概念

      • ​肽链主链有规律的折叠和盘绕，是肽链主链的局部空间排列

    • ​多肽链折叠的空间限制

      • ​肽平面是刚性平面——由于肽键具有部分双键的性质，C-N键不可自由旋转

      • ​二面角 φ和 ψ对主链构象的限制

        • ​ ϕ 角：-N-Cα-

        • ​ ψ角：-Cα-C-

        • ​ ω角：-C-N-

        • ​要考虑到氢原子与氧原子的立体结构，是否有重叠

      • ​拉氏构象图

      • ​肽链中主要是反式肽键， ω=180

    • ​蛋白质二级结构的基本类型

      • ​ α-螺旋（又叫3.6 13 - 螺旋）

        • ​ α-螺旋是常见的蛋白质二级结构

        •  $α$-螺旋是右手螺旋​ $α$
          

        • ​侧链在螺旋外侧

        • ​螺距0.54nm

        • ​每圈有3.6个氨基酸残基

        • ​其稳定结构是由其肽链中第n个氨基酸的羰基O与第n+4个氨基酸的亚氨基H形成

          • ​

        • ​ $α$ -螺旋的终结是脯氨酸残基

      • ​ β-折叠

        •  $β$ -折叠股

          • ​R-基交替位于折叠片上下两侧

          • ​ $α$ -C位于折叠线上

        • ​ $β$ -折叠片

        • ​平行的 $β$ -折叠片

        • ​反平行的 $β$ -的折叠片

        • ​相邻肽段主链上的C=O与N-H形成氢键，维持结构稳定性

          • ​反平行结构比平行结构更稳定

      • ​ β-转角

        • ​由四个连续的氨基酸残基组成

        • ​甘氨酸和脯氨酸常出现在 $β$ -转角中

      • ​无规卷曲

        • ​没有规律性的主链骨架构象

  • ​蛋白质的超二级结构

    • ​超二级结构的概念

    • ​超二级结构的类型

      • ​ αα （ α 螺旋的聚集体）

        • ​依靠螺旋链非极性边缘之间的疏水相互作用从而相互缠绕

      • ​ββ （ β 折叠的聚集体 ）

        • ​由两个反平行的 $β$ -折叠股经转角相连

        • ​蛋白质中，相邻的二级结构单元相互接近，形成有规则的二级结构聚集体

      • ​βαβ （ α螺旋和 β折叠的聚集体 ）

        • ​两个平行的 $β$ -折叠股和一段 α-螺旋组成

  • ​蛋白质的结构域

    • ​机构与之间以松散的肽链相连

    • ​结构域是球状蛋白的独立折叠单位

      • ​多肽链形成三级结构的局部折叠区，是相对独立的紧密球状实体，称为结构域

    • ​结构域的四种常见类型

      • ​ 全 α  结构域： α-螺旋占优势

      • ​ 全 β  结构域： β - 折叠片占优势

      • ​α  /  β 结构域： α  - 螺旋和 β  - 折叠股 相间

        排列，即互相掺合

      • ​α + β 结构域： α - 螺旋和 β  - 折叠股大部

        分 分开 聚集。

  • ​蛋白质的三级结构

    • ​三级结构的概念

      • ​蛋白质分子或亚基内所有原子的空间排布，但不涉及亚基之间的关系

    • ​三级结构举例：肌红蛋白

      • ​α- 螺旋占75-80%，有8段 α-螺旋

      • ​分子内部结合一个血红素，是结合氧的部位，除血红素外的蛋白质部分叫珠蛋白

      • ​血红素是原卟啉与铁的络合物，铁原子6个配位键中的四个与原卟啉环的N原子相连，其中，第6配位键与O2结合

        • ​

    • ​维持三级结构的作用力

      • ​疏水作用

      • ​离子键

      • ​氢键

      • ​范德华作用

      • ​静电作用

      • ​二硫键

  • ​蛋白质的四级结构

    • ​四级结构的定义

      • ​具有三级结构的蛋白质亚基按一定方式聚合成蛋白质大分子，即为蛋白质的四级结构

    • ​蛋白质的亚基

      • ​是蛋白质的最小共价单位，由一条多肽链或以共价键连接在一起的几条多肽链组成

      • ​亚基也称单体，由一个亚基组成的蛋白叫单体蛋白

    • ​四级结构举例——血红蛋白

      • ​四聚体α 2 β2，每个亚基结合一分子血红素

  • • ​纤维状蛋白质的结构，典型的均不溶于水

      • ​α-角蛋白

      • ​丝心蛋白及β-角蛋白

        • ​反平行的 $$β-折叠片平行排列而成的多层结构

      • ​胶原蛋白

        • ​基本结构单位——原胶原分子

        • ​三股螺旋形成的右手超螺旋

        • ​每条单链称为 α -链，左手螺旋结构 
          αα α

    • 球形蛋白质

      • ​多肽链折成紧密的球形，可溶于水，由广泛的生物功能

    • ​膜蛋白

• 肽

  • ​肽键

    • 肽键的定义：肽键是有一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基除去一分子水缩合而成

      • ​

    • ​肽键的结构

      • ​

        • ​肽键的C-N键具有部分双键的性质

        • ​肽键的平面性质：肽键不能自由旋转，组成肽基的4个原子和2个相邻的Cα原子处于同一平面，叫做肽平面

          • ​

        • 肽键的构型——以反式为主

  • ​肽

    • ​定义：氨基酸与氨基酸通过肽键连接形成的化合物叫肽

    • ​分类：根据组成氨基酸的数目

      • ​二肽：两个氨基酸组成的肽

      • ​寡肽：少于十个氨基酸形成的肽

        • ​氨基酸残基：两个氨基酸形成肽键时，氨基酸留在肽链上的部分叫氨基酸残基

          • ​命名:用——酰代替——酸，如丙氨酰代替丙氨酸。

          • ​

      • ​多肽：多于十个氨基酸形成的肽

    • ​肽的两个末端

      • ​氨基端/N-端：有游离的α-氨基

      • ​羧基端/C-端：有游离的α-羧基

    • ​肽的书写

      • ​从N-端写到C-端，从左写到右

    • ​主链

      • ​肽链的骨架是由-N-Cα-C-序列重复排列而成

        • ​

    • ​肽的命名

      • ​根据肽的生物功能

      • ​根据肽的来源

      • ​根据肽的氨基酸排列顺序

      • ​根据组成肽的氨基酸的排列顺序命名

        • ​按从N-端到C-端的氨基酸排列顺序命名，除了C-端的氨基酸残基仍然称为氨基酸，其余氨基酸残基改为——酰。（注意：N-端也要改变！！）

  • ​天然活性肽

    • ​肽类激素：催产素、加压素

    • ​抗生素：缬氨霉素、短杆菌肽S

    • ​脑啡肽

    • ​氧化还原缓冲剂：谷胱甘肽