酶的专一性:
是指在一定的条件下, 一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型反应的特性。
酶工程第一章 |
酶工程第一章
第四节酶的分类与命名
蛋白酶P
核酶R
第二节 酶催化作用的特点
一、酶催化作用的专一性强
酶的专一性:
是指在一定的条件下, 一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型反应的特性。
绝对专一性
一种酶只能催化一种底物进行一种反应
当酶作用的底物含有不对称碳原子时 , 酶只能作用于异构体的一种。这种绝对专一性称为立体异构专一性。
相对专一性
一种酶能够催化一类结构相似的底物进行某种相同类型的反应
基团专一性的酶则要求底物含有某一相同的基团
键专一性的酶能够作用于具有相同化学键的一类底物
二、酶催化作用的效率高
三、酶催化作用的条件温和
一是由于酶催化作用所需的活化能较低 , 二是由于酶是具有生物催化功能的生物大分子,在高温、高压、过高或过低 pH 值等极端条件下, 大多数酶会变性失活而失去其催化功能。
活化能
酶是生物大分子
第五节 酶的活力测定
酶活力:
是指在一定条件下,酶所催化的反应初速度。在外界条件相同的情况下,反应速度越大,意味着酶活力越高。 酶催化反应速度,通常用单位时间(t)内底物(S)的减少量或产物(P)的增加量表示。
测定方法
1根据酶催化的专一性选择适宜的底物, 并配制成一定浓度的底物溶液。
根据酶的动力学性质,确定酶催化反应的温度、pH值、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。
3.在一定的条件下,将一定量的酶液和底物溶液混合均匀,适时记下反应开始的时间。
4.反应到一定的时间,取出适量的反应液, 运用各种生化检测技术,测定产物的生成量或底物的减少量。
终止反应
加热或者低温
酶变性剂
加酸碱
酶活力单位
在特定条件下(温度可采用25℃,pH值等条件均采用最适条件),每1min催化1μmol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位, 这个单位称为国际单位(IU)。
在特定条件下,每ls催化1mol底物转化为产物的酶量定义为1卡特(kat)。
酶的比活力是酶纯度的一个指标,是指在特定条件下,单位重量(mg)蛋白质或RNA所具有的酶活力单位数。= 酶活力(单位)/mg(蛋白或RNA)
三、酶的转换数与催化周期
酶的转换数KP(Kcat),又称为摩尔催化活性,是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数(微摩尔数)。
四、固定化酶的活力测定
固定化酶:
与水不溶性载体结合、在一定的空间范围内起催化作用的酶称为固定化酶。
1. 振荡测定法
称取一定重量的固定化酶,放进一定形状一定大小的容器中加入一定量的底物溶液,在特定的条件下,一边振荡或搅拌,一边进行催化反应。经过一定时间,取出一定量的反应液测定酶活力。
2. 酶柱测定法
将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱中,在适宜的条件下让底物溶液以一定的流速流过酶柱,收集流出的反应液。测定反应液中底物的消耗量或产物的生成量,再计算酶活力。
3. 连续测定法
测定时,可将振荡反应器中的反应液连续引到连续测定仪(如双束紫外分光光度计等) 的流动比色杯中进行连续分光测定,或者让固定化酶柱流出的反应液连续流经流动比色杯进行连续分光测定。
酶结合效率:
又称为酶的固定化率,是指酶与载体结合的百分率。
加入的总酶活力-未结合的酶活力/加入的总酶活力 酶活力回收率=固定化酶总活力/用于固定化的总酶活力 ╳100%
第三节 影响酶催化作用的因素
一、底物浓度的影响
米氏方程 V=VmS/(Km+S)
km的物理意义:
为酶催化反应速度等于最大反应速度一半时的底物浓度。
v---反应速度;S ---底物浓度 ;Vm---最大反应速度 ;km---米氏常数
在底物浓度较低的情况下, 酶催化反应速度与底物浓度成正比,反应速度随着底物浓度的增加而加快。
当底物浓度达到一定的数值时,反应速度的上升不再与底物浓度成正比, 而是逐步趋向平衡。
二、酶浓度的影响
在底物浓度足够高的条件下,酶催化反应速度与酶浓度成正比。它们之间的关系可以用下式表示 :V=k[E]
三、温度的影响
在最适温度条件下,酶的催化反应速度达到最大
注意:
1.在其他条件相同的情况下,温度每升高10℃,酶促反应速度增加1-2倍。
2.酶是生物大分子,当温度升高时,酶的活性会受到影响,甚至引起变性而丧失其催化活性。
3.一般酶在 60℃ 以上容易变性失活。但也有一些酶的热稳定性较高。
4.添加酶的作用底物或者某些稳定剂可以适当提高酶的热稳定性。
四、pH值的影响
在最适 pH 值条件下, 酶催化反应速度达到最大。
原因
pH值影响酶催化作用的原因:
主要是由于在不同的 pH 值条件下,酶分子和底物分子中基团的解离状态发生改变,从而影响酶分子的构象以及酶与底物的结合能力和催化能力。在极端的 pH 值条件下,酶分子的空间结构发生改变,从而引起酶的变性失活。
五、抑制剂的影响
抑制剂:能够使酶的催化活性降低或者丧失的物质称为酶的抑制剂。
内源抑制剂是细胞正常代谢的产物,在细胞的代谢调节中起作用
色氨酸抑制邻氨基苯甲酸合成酶的催化活性 , 从而调节色氨酸的生物合成等。
外源抑制剂占大多数,主要的外源抑制剂有各种无机离子、小分子有机物和蛋白质等
例如 , 银 (Ag+) 、汞 (Hg2+) 、铅 (Pb2+)
按作用机制来划分:抑制剂有可逆性抑制剂和不可逆抑制剂。
可逆抑制剂:只要将抑制剂除去 , 酶活性即可恢复。
不可逆抑制剂
1. 竞争性抑制
竞争性抑制剂与底物结构相似,与酶分子结合以后,底物分子就不能与酶分子结合
随着底物浓度增加酶的抑制作用减弱。
竞争性抑制的特点是酶催化反应的最大反应速度 Vm不变,而米氏常数 Km增大。截距不变
2. 非竞争性抑制
非竞争性抑制剂是与酶的活性中心以外的位点结合 , 所以 , 抑制剂的分子结构可能与底物的分子结构毫不相关。
非竞争性抑制剂是与酶的活性中心以外的位点结合 , 所以 , 抑制剂的分子结构可能与底物的分子结构毫不相关。 与X交点不变
3. 反竞争性抑制
在底物与酶分子结合生成中间复合物后,抑制剂再与中间复合物结合引起的抑制作用称为反竞争性抑制。
不能通过增加底物浓度使反竞争抑制作用逆转。
反竞争性抑制的特点是最大反应速度 Vm 和米氏常数 Km 同时减小 斜率不变 。
六、激活剂的影响
在激活剂的作用下,酶的催化活性提高或者由无活性的酶原生成有催化活性的酶。
常见的激活剂有:
Ca2+、Mg2+、Co2+、Zn2+、Mn2+等金属离子和Cl-等无机阴离子。有的酶也可以作为激活剂
第六节 酶的生产方法
提取分离法
盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等
在酶的提取时,首先应当根据酶的结构和性质,选择适当的溶剂:
一般说来,亲水性的酶要采用水溶液提取,疏水性的酶或者被疏水物质包裹的酶要采用有机溶剂提取;
等电点偏于碱性的酶应采用酸性溶液提取,等电点偏于酸性的酶应采用碱性溶液提取;
酶的分离纯化:
是采用各种生化分离技术如离心分离、过滤与膜分离、萃取分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离以及浓缩、结晶、干燥等,使酶与各种杂质分离,达到所需的纯度,以满足使用的要求。
生物合成法
利用微生物细胞、植物细胞或动物细胞的生命活动而获得人们所需酶的技术过程。
生物合成法产酶:
1.首先要经过筛选、诱变、细胞融合、基因重组等方法获得优良的产酶细胞。
2.然后在人工控制条件的生物反应器中进行细胞培养,通过细胞内物质的新陈代谢作用,生成各种代谢产物。
3.经过分离纯化得到人们所需的酶。
化学合成法